Metodologie e modelli sperimentali per l'utilizzo terapeutico degli ormoni

Nel corso saranno presentate e discusse le principali tecniche di biologia molecolare, utilizzando
un'ottica applicativa circa il problema biologico dell'uso degli ormoni a fini terapeutici e degli
strumenti utili a studiare il loro meccanismo.
In particolare, verranno affrontate le seguenti tematiche:
Studio del genoma applicato agli ormoni:
Estrazione degli acidi nucleici per lo studio di espressione genica, quantificazione, elettroforesi
Studio del DNA attraverso endonucleasi di restrizione
PCR; RT-PCR; Real-Time PCR
Studio dei promotori; design di oligonucleotidi per Real-Time PCR
Sequenziamento; micro e macroRNA
Ormoni proteici, recettori ed enzimi:
Estrazione proteica, quantificazione, immunoblotting
Immunoistochimica
ELISA e Radio Immuno Assay
Cromatografia e Spettrometria di massa: concetti generali
Le interazioni proteine-DNA:
EMSA; DNase I Footprinting
Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP)
SELEX
Altri metodi:
LC-MS/MS, esempi pratici (set up di un metodo; estrazione di molecole steroidee e catecolamine
da tessuto)
Modelli animali applicati allo studio di condizioni ormonali specifiche:
Mantenimento colonia, genotyping
Strisci: ciclo ovarico nel roditore
Modelli animali per lo studio della fisiopatologia endocrina
Modelli animali per lo studio del differenziamento sessuale
Infezione con virus (ICV)
L'optogenetica per lo studio degli ormoni
Tecniche innovative per lo studio degli ormoni
Analisi comportamentali nei roditori
Utilizzo terapeutico degli ormoni

fisici (elettroporazione, microiniezione e gene gun).
Vettori virali: vantaggi e svantaggi. I vettori adenovirali, lentivirali, AAV, Herpes Simplex-based.
Produzione di vettori virali: modifica del genoma virale, cellule di packaging, titolazione e analisi dei
revertanti replicazione competenti, principali norme di sicurezza per lavorare con i virus.
Trasfezioni transienti e stabili; vettori plasmidici, vettori di trasformazione con promotori virali, per
espressione inducibile (tet on/tet off), sistemi reporter.
Il genome editing: le homing-endonucleases, i sistemi zinc-fingers, i TALENs, la tecnologia
CRISPR/Cas9.
-La fluorescenza e le sue applicazioni per lo studio delle colture cellulari.
Principi di base della fluorescenza. I fluorocromi, le proteine fluorescenti e le chimere fluorescenti.
Il microscopio a fluorescenza e confocale. Immunocitochimica ed immunofluorescenza: fissaggio
delle cellule, permeabilizzazione, rilevazione mediante utilizzo di anticorpi fluorescenti primari e
secondari. Esempi di applicazioni di utilizzo di proteine/composti fluorescenti per marcare organelli,
per misurare attività cellulari.
Tecniche di microscopia a fluorescenza: FRET, FRAP, iFRAP, FLIP, FLAP.
-La citofluorimetria.
Introduzione alla citofluorimetria, il citofluorimetro, parametri misurabili (densità di una
sospensione cellulare, complessità, dimensione e forma delle cellule analizzate, detection di dyes
fluorescenti. Esempi di applicazioni: identificazione di diversi tipi cellulari all'interno di una
campione, cell sorting, studio della proliferazione e del ciclo cellulare, misura dell'apoptosi.
-Saggi su colture cellulari.
Saggi di vitalità e mortalità cellulare: basati sull'integrità' della membrana (colorazione con trypan
blue, colorazione con calceina-acetossi metile, colorazione con ioduro di propidio, rilascio
dell'enzima glucosio 6P deidrogenasi, rilascio della lattato deidrogenasi), basati sul potenziale redox
(saggio alamar-blue, saggio MTT), basati sulla funzionalità' mitocondriale (test dell'ATP).
Tecniche per lo studio di migrazione, invasione, adesione e proliferazione cellulare (camera di
Boyden, aggregati in matrigel, saggio di adesione cellulare).
- Esempi di impiego di colture cellulari per lo studio degli ormoni.