Metodologie cellulari e biochimiche

METODOLOGIE CELLULARI
La parte di metodologie cellulari ha lo scopo di fornire le basi relative ai metodi per l'ottenimento, la crescita e la manipolazione di modelli cellulari. Nel corso verranno trattati i seguenti argomenti:
Didattica frontale (2 CFU)
- Le colture cellulari di mammifero. Vantaggi e svantaggi delle colture cellulari. Linee cellulari primarie: ottenimento e mantenimento. Disaggregazione dei tessuti e colture primarie. Separazione e caratterizzazione di specifici tipi cellulari presenti in un tessuto. Linee cellulari stabilizzate e/o immortalizzate: ottenimento e mantenimento. I fattori di trasformazione, l'immortalizzazione di cellule mediata da oncogeni, i sistemi ibridi ottenuti da fusioni cellulari. Immortalizzazione specifica con agenti trasformanti: tumorigenesi diretta. Cellule staminali e cellule staminali indotte pluripotenti (iPSC).
- Il laboratorio per colture cellulari di mammifero. La sterilità, i dispositivi di protezione individuale e di protezione collettiva, le cappe di sicurezza biologica, gli incubatori, piccola strumentazione e supporti per colture cellulare. Misure di sicurezza e rischi associati. Tecniche di sterilizzazione a calore secco e a calore umido, filtrazioni.
- Mantenimento di una coltura cellulare. L'ambiente delle colture: substrati, medium di coltura, temperatura, fattori di crescita, tipi di siero e additivi chimici. Metodi di coltura (sospensione, adesione, coltura in monostrato e 3D), substrati per colture cellulari in adesione, analisi della morfologia delle colture cellulari. Analisi delle curve di crescita di una coltura cellulare, la subcoltura, distacco meccanico o enzimatico, la conta cellulare e la semina. Saggi di vitalità e mortalità cellulare: colorazione con trypan blue, colorazione con calceina-acetossi metile, colorazione con ioduro di propidio, rilascio dell'enzima lattato deidrogenasi, saggio alamar-blue, saggio MTT, test dell'ATP. Valutazione della proliferazione cellulare. La crioconservazione delle linee cellulari.
-Ingegneria cellulare. I cargo genetici per sovraespressione o silenziamento genico: plasmidi a DNA, oligonulceotidi antisenso, siRNA e micro-RNA, mRNA, fagi e cosmidi. Tecniche di trasfezione cellulare per lo studio dell'espressione genica e per l'analisi di proteine. Vettori di trasfezione non virali: metodi chimici (calcio cloruro, DEAE-destrano, lipofezione) e metodi fisici (elettroporazione, microiniezione e gene gun). Vettori virali: vantaggi e svantaggi. I vettori adenovirali, lentivirali, AAV. Produzione di vettori virali: modifica del genoma virale, cellule di packaging, titolazione e analisi dei revertanti replicazione competenti, principali norme di sicurezza per lavorare con i virus. Trasfezioni transienti, stabili (trasposasi e Flp-in) e stabili inducibili (tet on/tet off), sistemi reporter. Il genome editing: i sistemi zinc-fingers, i TALENs e la tecnologia CRISPR/Cas9.
-La fluorescenza e le sue applicazioni per lo studio delle colture cellulari. Principi di base della fluorescenza. I fluorocromi, le proteine fluorescenti e le chimere fluorescenti. Il microscopio a fluorescenza. Immunofluorescenza: fissaggio delle cellule, permeabilizzazione, rilevazione mediante utilizzo di anticorpi fluorescenti primari e secondari. Esempi di applicazioni di utilizzo di proteine/composti fluorescenti per marcare organelli, per misurare attività cellulari. Tecniche di microscopia a fluorescenza: FRET e FRAP.

Esercitazioni a posto singolo (1.5 CFU)
Durante le esercitazioni di laboratorio sarà insegnato agli studenti a lavorare in condizioni di sterilità in una cappa di sicurezza biologica, introducendoli alle tecniche base di manipolazione delle colture cellulari di mammifero. Gli studenti impareranno a valutare lo stato di salute di una coltura cellulare, a staccare le cellule mediante tripsinizzazione, a contarle e ad effettuare una semina cellulare. Sulle cellule seminate, ciascuno studente sperimenterà diverse metodiche illustrate nelle lezioni frontali, tra cui: la trasfezione, un saggio di vitalità cellulare, un saggio di mortalità cellulare, la valutazione dell'efficienza di trasfezione mediante saggio dell'attività dell'enzima beta-galattosidasi. Inoltre, gli studenti impareranno ad elaborare i dati ottenuti utilizzando MS Excel. Al termine delle esercitazioni ciascuno studente dovrà presentare i dati ottenuti in una relazione scritta, che concorrerà alla valutazione finale.

METODOLOGIE BIOCHIMICHE
Nel corso saranno trattati i seguenti argomenti:

Didattica Frontale (inclusi seminari ed esercitazioni in aula)
- Analisi quantitativa dell'espressione genica: definizione e metodologie, concetti di base della PCR, schema operativo di qRT-PCR, approcci per la rivelazione dell'amplificazione in real time, metodi per l'analisi quantitativa dei dati; qRT-PCR applicata ai miRNA.
- Tecniche per lo studio delle interazioni tra macromolecole: co-(immuno)precipitazione con proteine native o di fusione, GST-pull down e approcci affini, studio delle interazioni mediante FRET (in vitro e in vivo); analisi delle interazioni tra proteine e acidi nucleici mediante Electrophoretic mobility shift assay, analisi delle interazioni tra proteine e DNA nel contesto della cromatina (Chromatin immunoprecipitation), analisi delle proteine che interagiscono con RNA (RNA immunoprecipitation)
- Approcci per lo studio del proteoma: definizione generale di proteoma, di analisi proteomica e relativi approcci metodologici; applicazione della spettrometria di massa per la determinazione del peso molecolare delle proteine (MALDI-TOF, ionizzazione mediante electrospray); approcci per l'identificazione delle proteine: 2D-gel elettroforesi, digestione enzimatica, sequenziamento mediante tandem mass spectrometry, pattern di frammentazione dei peptidi, analisi quantitativa in spettrometria di massa.
- Approcci per lo studio del metaboloma: definizione generale di metaboloma, di analisi metabolomiche e relativi approcci metodologici; targeted metabolomics: preparazione del campione, strumentazione, esempi di applicazioni; untargeted metabolomics: preparazione del campione, strumentazione, esempi di applicazioni; analisi statistica dei dati di metabolomica.
- Approcci per lo studio del metabolismo energetico: metodi per l'analisi della morfologia mitocondriale, metodi per l'analisi della densità e della biogenesi mitocondriale, metodi per l'analisi della respirazione in colture cellulari e in modelli animali, misura della sintesi di ATP, del potenziale di membrana, delle specie reattive dell'ossigeno, e delle principali vie metaboliche mitocondriali.
- Tecniche di nuova generazione per il sequenziamento degli acidi nucleici: introduzione alle tecniche di sequenziamento di nuova generazione; tecnologie di sequenziamento mediante sintesi: applicazioni (interazioni DNA-proteina, RNA-seq, interazioni RNAproteina, metilazione del DNA, whole genome sequencing, de novo sequencing); preparazione delle libraries; sequenziamento (multiplex sequencing, cluster generation); analisi dei dati.

Esercitazioni a posto singolo
- Disegno di primers e probe per Real time PCR, analisi quantitativa dei dati di qRT-PCR e di metabolomica targeted, cenni di analisi di dati di Next generation sequencing (laboratorio informatico)
- Isolamento di acidi nucleici da cellule in coltura, allestimento per la reazione di PCR e analisi dei prodotti di amplificazione mediante elettroforesi in gel d'agarosio; frazionamento cellulare, analisi del profilo proteico delle frazioni cellulari mediante SDS-PAGE, determinazione della concentrazione proteica delle frazioni cellulari mediante metodo colorimetrico, analisi del metabolismo mitocondriale (laboratorio biologico).
I contenuti delle esercitazioni saranno oggetto di prove individuali che concorreranno alla valutazione finale.