Metodologie cellulari e biochimiche

A.A. 2024/2025
7
Crediti massimi
84
Ore totali
SSD
BIO/10 BIO/13
Lingua
Italiano
Obiettivi formativi
L'insegnamento si propone di:
- fornire una adeguata descrizione delle tecniche utilizzate per la crescita e la manipolazione di cellule "in vitro" e sull'utilizzo dei diversi tipi di coltura cellulare in campo biotecnologico;
- presentare i principi e le applicazioni dei metodi e degli approcci di base ed avanzati per lo studio di molecole biologicamente attive e di processi biochimici e molecolari, con particolare riferimento agli approcci biotecnologici impiegati nella moderna ricerca biochimica e biomedica;
- approfondire dal punto vista metodologico le conoscenze acquisite nelle altre discipline del corso di studi svolte nei semestri precedenti (Biologia generale e cellulare, Biochimica e Biologia molecolare).
Con la parte teorica, l'insegnamento contribuisce al consolidamento delle conoscenze di base a livello molecolare e cellulare dei sistemi viventi. Attraverso le esercitazioni di laboratorio gli studenti hanno l'opportunità di familiarizzare con la manipolazione di cellule in coltura in condizioni di sterilità e con l'uso di tecniche biochimiche e bio-molecolari di base, in linea con i profili professionali e gli sbocchi occupazionali previsti per l'intero percorso formativo.
Inoltre, l'insegnamento contribuisce a fornire le basi per il proseguimento degli studi nei corsi di laurea magistrale in area biotecnologica e bio-medica.
Risultati apprendimento attesi
Al termine dell'insegnamento lo studente dovrà aver acquisito le nozioni teoriche e pratiche relative alle principali metodologie cellulari e biochimiche in uso nei laboratori di ricerca e di analisi in ambito bio-medico. In particolare, lo studente dovrà aver acquisito competenze di base per la manipolazione di cellule eucariotiche in condizioni di sterilità e la capacità di eseguire protocolli standard per l'analisi di proteine e acidi nucleici. Inoltre, lo studente dovrà essere in grado di: individuare le tecniche o gli approcci sperimentali più idonei in funzione del contesto di applicazione; individuare la soluzione corretta o più adeguata attraverso simulazioni di casi sperimentali; analizzare in modo critico i risultati ottenuti in seguito all'applicazione delle tecniche studiate e/o messe in pratica durante le esercitazioni di laboratorio.
Corso singolo

Questo insegnamento può essere seguito come corso singolo.

Programma e organizzazione didattica

Edizione unica

Responsabile
Periodo
Secondo semestre

Programma
METODOLOGIE CELLULARI
La parte di metodologie cellulari ha lo scopo di fornire le basi relative ai metodi per l'ottenimento, la crescita e la manipolazione di modelli cellulari. Nel corso verranno trattati i seguenti argomenti:
Didattica frontale (2 CFU)
- Le colture cellulari di mammifero. Vantaggi e svantaggi delle colture cellulari. Linee cellulari primarie: ottenimento e mantenimento. Disaggregazione dei tessuti e colture primarie. Separazione e caratterizzazione di specifici tipi cellulari presenti in un tessuto. Linee cellulari stabilizzate e/o immortalizzate: ottenimento e mantenimento. I fattori di trasformazione, l'immortalizzazione di cellule mediata da oncogeni, i sistemi ibridi ottenuti da fusioni cellulari. Immortalizzazione specifica con agenti trasformanti: tumorigenesi diretta. Cellule staminali e cellule staminali indotte pluripotenti (iPSC).
- Il laboratorio per colture cellulari di mammifero. La sterilità, i dispositivi di protezione individuale e di protezione collettiva, le cappe di sicurezza biologica, gli incubatori, piccola strumentazione e supporti per colture cellulare. Misure di sicurezza e rischi associati. Tecniche di sterilizzazione a calore secco e a calore umido, filtrazioni.
- Mantenimento di una coltura cellulare. L'ambiente delle colture: substrati, medium di coltura, temperatura, fattori di crescita, tipi di siero e additivi chimici. Metodi di coltura (sospensione, adesione, coltura in monostrato e 3D), substrati per colture cellulari in adesione, analisi della morfologia delle colture cellulari. Analisi delle curve di crescita di una coltura cellulare, la subcoltura, distacco meccanico o enzimatico, la conta cellulare e la semina. Saggi di vitalità e mortalità cellulare: colorazione con trypan blue, colorazione con calceina-acetossi metile, colorazione con ioduro di propidio, rilascio dell'enzima lattato deidrogenasi, saggio alamar-blue, saggio MTT, test dell'ATP. Valutazione della proliferazione cellulare. La crioconservazione delle linee cellulari.
-Ingegneria cellulare. I cargo genetici per sovraespressione o silenziamento genico: plasmidi a DNA, oligonulceotidi antisenso, siRNA e micro-RNA, mRNA, fagi e cosmidi. Tecniche di trasfezione cellulare per lo studio dell'espressione genica e per l'analisi di proteine. Vettori di trasfezione non virali: metodi chimici (calcio cloruro, DEAE-destrano, lipofezione) e metodi fisici (elettroporazione, microiniezione e gene gun). Vettori virali: vantaggi e svantaggi. I vettori adenovirali, lentivirali, AAV. Produzione di vettori virali: modifica del genoma virale, cellule di packaging, titolazione e analisi dei revertanti replicazione competenti, principali norme di sicurezza per lavorare con i virus. Trasfezioni transienti, stabili (trasposasi e Flp-in) e stabili inducibili (tet on/tet off), sistemi reporter. Il genome editing: i sistemi zinc-fingers, i TALENs e la tecnologia CRISPR/Cas9.
-La fluorescenza e le sue applicazioni per lo studio delle colture cellulari. Principi di base della fluorescenza. I fluorocromi, le proteine fluorescenti e le chimere fluorescenti. Il microscopio a fluorescenza. Immunofluorescenza: fissaggio delle cellule, permeabilizzazione, rilevazione mediante utilizzo di anticorpi fluorescenti primari e secondari. Esempi di applicazioni di utilizzo di proteine/composti fluorescenti per marcare organelli, per misurare attività cellulari. Tecniche di microscopia a fluorescenza: FRET e FRAP.

Esercitazioni a posto singolo (1.5 CFU)
Durante le esercitazioni di laboratorio sarà insegnato agli studenti a lavorare in condizioni di sterilità in una cappa di sicurezza biologica, introducendoli alle tecniche base di manipolazione delle colture cellulari di mammifero. Gli studenti impareranno a valutare lo stato di salute di una coltura cellulare, a staccare le cellule mediante tripsinizzazione, a contarle e ad effettuare una semina cellulare. Sulle cellule seminate, ciascuno studente sperimenterà diverse metodiche illustrate nelle lezioni frontali, tra cui: la trasfezione, un saggio di vitalità cellulare, un saggio di mortalità cellulare, la valutazione dell'efficienza di trasfezione mediante saggio dell'attività dell'enzima beta-galattosidasi. Inoltre, gli studenti impareranno ad elaborare i dati ottenuti utilizzando MS Excel. Al termine delle esercitazioni ciascuno studente dovrà presentare i dati ottenuti in una relazione scritta, che concorrerà alla valutazione finale.

METODOLOGIE BIOCHIMICHE
Nel corso saranno trattati i seguenti argomenti:

Didattica Frontale (inclusi seminari ed esercitazioni in aula)
- Analisi quantitativa dell'espressione genica: definizione e metodologie, concetti di base della PCR, schema operativo di qRT-PCR, approcci per la rivelazione dell'amplificazione in real time, metodi per l'analisi quantitativa dei dati; qRT-PCR applicata ai miRNA.
- Tecniche per lo studio delle interazioni tra macromolecole: co-(immuno)precipitazione con proteine native o di fusione, GST-pull down e approcci affini, studio delle interazioni mediante FRET (in vitro e in vivo); analisi delle interazioni tra proteine e acidi nucleici mediante Electrophoretic mobility shift assay, analisi delle interazioni tra proteine e DNA nel contesto della cromatina (Chromatin immunoprecipitation), analisi delle proteine che interagiscono con RNA (RNA immunoprecipitation)
- Approcci per lo studio del proteoma: definizione generale di proteoma, di analisi proteomica e relativi approcci metodologici; applicazione della spettrometria di massa per la determinazione del peso molecolare delle proteine (MALDI-TOF, ionizzazione mediante electrospray); approcci per l'identificazione delle proteine: 2D-gel elettroforesi, digestione enzimatica, sequenziamento mediante tandem mass spectrometry, pattern di frammentazione dei peptidi, analisi quantitativa in spettrometria di massa.
- Approcci per lo studio del metaboloma: definizione generale di metaboloma, di analisi metabolomiche e relativi approcci metodologici; targeted metabolomics: preparazione del campione, strumentazione, esempi di applicazioni; untargeted metabolomics: preparazione del campione, strumentazione, esempi di applicazioni; analisi statistica dei dati di metabolomica.
- Approcci per lo studio del metabolismo energetico: metodi per l'analisi della morfologia mitocondriale, metodi per l'analisi della densità e della biogenesi mitocondriale, metodi per l'analisi della respirazione in colture cellulari e in modelli animali, misura della sintesi di ATP, del potenziale di membrana, delle specie reattive dell'ossigeno, e delle principali vie metaboliche mitocondriali.
- Tecniche di nuova generazione per il sequenziamento degli acidi nucleici: introduzione alle tecniche di sequenziamento di nuova generazione; tecnologie di sequenziamento mediante sintesi: applicazioni (interazioni DNA-proteina, RNA-seq, interazioni RNAproteina, metilazione del DNA, whole genome sequencing, de novo sequencing); preparazione delle libraries; sequenziamento (multiplex sequencing, cluster generation); analisi dei dati.

Esercitazioni a posto singolo
- Disegno di primers e probe per Real time PCR, analisi quantitativa dei dati di qRT-PCR e di metabolomica targeted, cenni di analisi di dati di Next generation sequencing (laboratorio informatico)
- Isolamento di acidi nucleici da cellule in coltura, allestimento per la reazione di PCR e analisi dei prodotti di amplificazione mediante elettroforesi in gel d'agarosio; frazionamento cellulare, analisi del profilo proteico delle frazioni cellulari mediante SDS-PAGE, determinazione della concentrazione proteica delle frazioni cellulari mediante metodo colorimetrico, analisi del metabolismo mitocondriale (laboratorio biologico).
I contenuti delle esercitazioni saranno oggetto di prove individuali che concorreranno alla valutazione finale.
Prerequisiti
Sono consigliate le seguenti propedeuticità:
- Biologia generale e cellulare
- Biologia molecolare
- Biochimica
Metodi didattici
I docenti utilizzeranno a) lezioni frontali (2 CFU Metodologie Cellulari; 1.5 CFU Metodologie Biochimiche), b) seminari e/o esercitazioni in aula (0.5 CFU Metodologie Biochimiche), e c) esercitazioni a posto singolo in laboratorio (1.5 CFU Metodologie Cellulari; 1.5 CFU Metodologie Biochimiche).
Materiale di riferimento
METODOLOGIE CELLULARI
Agli studenti verranno fornite le slides presentate a lezione in pdf (piattaforma myAriel); come testi di consultazione vengono consigliati:
1) "Colture cellulari" di Mariantonietta Meloni, Aracne editrice;
2) CULTURE OF ANIMAL CELLS R. Ian Freshney Wiley-Blackwell.

METODOLOGIE BIOCHIMICHE
Si consigliano i seguenti testi per consultazione:
A.J. Ninfa, D.P. Ballou, Metodologie di Base per la Biochimica e la Biotecnologia, Zanichelli
Watson, Baker, Bell, Gann, Levine, Losic, Biologia Molecolare del Gene, Zanichelli
Nelson, Cox, Principi di Biochimica di Lehninger, Zanichelli
Materiale iconografico in formato digitale fornito dal docente via internet tramite il sito Ariel o altre piattaforme interattive
Modalità di verifica dell’apprendimento e criteri di valutazione
L'esame si svolgerà in forma scritta e avrà una durata complessiva di 2 ore.
La prova sarà volta a:
- valutare il livello di conoscenza e comprensione degli argomenti trattati nelle lezioni frontali e nelle esercitazioni di laboratorio sia della parte di metodologie cellulari che di quella di metodologie biochimiche;
- verificare la capacità di applicare le conoscenze acquisite a casi specifici, prendendo spunto sia dagli esempi svolti durante le esercitazioni sia da studi pubblicati su riviste scientifiche;
- accertare la capacità di descrivere gli argomenti con chiarezza e ove richiesto con termini specifici delle discipline biologiche e biotecnologiche.
Per ciascuna parte (metodologie cellulari/metodologie biochimiche) la prova scritta consisterà in: 10 domande a scelta multipla (1 punto per ogni risposta esatta e 0 punti per ogni risposta errata o non indicata) e 3 domande aperte (massimo 6 punti per ogni risposta). Al punteggio ottenuto in ciascuna parte verrà sommata la valutazione della relativa relazione di laboratorio (massimo 5 punti). Un punteggio non inferiore a 18 in ciascuna parte è necessario per il superamento dell'esame.
La valutazione complessiva sarà espressa in trentesimi e risulterà dalla media ponderata dei punteggi ottenuti nelle singole parti.
BIO/10 - BIOCHIMICA - CFU: 3.5
BIO/13 - BIOLOGIA APPLICATA - CFU: 3.5
Esercitazioni: 8 ore
Esercitazioni di laboratorio a posto singolo: 48 ore
Lezioni: 28 ore
Docente/i
Ricevimento:
Su Appuntamento
DiSFeB, via Trentacoste 2, piano 4 e MS Teams
Ricevimento:
su appuntamento
DiSFeB, via Balzaretti 9, piano 4 e MS Teams
Ricevimento:
Da concordare via email
via Balzaretti 9